当细胞如玻璃般清透：前所未有精细度绘制小鼠大脑

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　　现有技术可使组织像玻璃一样清晰透明并将其膨胀至其原始尺寸的数倍，这为窥探生物系统的内部运作提供了前所未有的机会。

　　2018年3月，日本的研究人员以前所未有的精细度绘制了小鼠大脑的细胞组成。

　　日本RIKEN生物系统动力学研究中心的系统生物学家上田泰己及其团队，使用一种名为CUBIC-X的技术，绘制了一张小鼠大脑图谱。他们采用化学方法标记了大脑中的每个细胞，然后在将大脑透明化的同时将其尺寸扩大了十倍。随后他们利用精密的成像技术对神经元进行了三维重建，据上田泰己介绍，总计约7200万个细胞。

　　所得图谱将大脑缩小为一个简洁的细胞位置数据库，研究团队可以根据这个数据库研究发育过程中不同大脑区域具体发生的变化。未来，这个数据库还可以推动对特定大脑结构，譬如控制睡眠-觉醒周期等行为的区域，进行更深入的探索。

　　这类方法的工具箱正在不断扩大，CUBIC-X只是其中之一，它利用现成的化学物质为研究人员打开了一扇窗，让其不仅可以观察大脑，还几乎可以观察其他任何一个器官。

　　其中一些方法对组织进行了清除，使不透明的组织变为透明；另一些则在清除组织的基础上将器官按比例放大，让更多细节得以暴露在传统显微镜下。具体选择哪种方法由具体的科学问题决定。有许多不同方法可以达到类似的目的，而使用者应在决定选择哪一种方法前研究清楚各自的优势和局限性。

　　大脑成像——组织清除技术

　　神经科学家最早对组织清除技术产生了需求；他们因为无法追踪大脑中轴突和树突的蜿蜒路径而倍感受挫。

　　通常情况下，这类研究会对标记的脑组织切片连续成像，然后借由计算机进行三维重建。但这个过程十分缓慢：利用显微镜需要花上几个星期才能成像小鼠大脑中的回路。构建出来的图谱完全取决于输入数据的质量。

　　加州理工学院的神经科学家Viviana Gradinaru说：“大多数情况下，你只是对部分切片进行了采样，因此重建效率并不高。此外，切割还会损害组织表面及边缘，致使你无法将它们重新连接起来。”

　　另一种更好的方法是使组织透明化，然后将其完整地成像。但只有到了近几十年，分子试剂、遗传策略和成像技术取得了长足发展，这才成为了可能。

　　想要照亮大脑的内部，脂质是头号公敌。当穿过水溶液的光遇到脂质表面时，折射率的变化会使其发生弯曲和散射。“想想吉露果子冻 [果冻]：它主要由蛋白质组成，而且是半透明的，”Gradinaru说，“但如果你在吉露果子冻里添加奶油，那它就不再透明了。奶油就是脂质组成的。”

　　细胞和细胞器膜主要由脂质组成，包裹轴突的髓鞘也是。对大脑组织进行清除指的就是清除这些脂质分子，但保留其余的分子。

　　1911年，德国解剖学家Werner Spalteholz首次展示了清除不透明组织的方法，他利用化学溶剂消除了会引起光散射的生物分子。但是这种方法并不适合今天的荧光试剂，而且会对组织结构造成损害。

　　2011年，维也纳科技大学的脑部影像专家Hans-Ulrich Dodt、现如今在德国慕尼黑大学的AliErtürk和德国神经退行性疾病中心的Frank Bradke描述了最早的现代组织清除技术之一。

　　该方法被称为3DISCO，在原理上传承了Spalteholz的方法，但使用了更温和的化学溶剂混合物溶解脂质，同时保留细胞结构，使标本脱水和硬化成透明的框架，从而保留组织的原始结构。

　　法国国家健康与医学研究院（INSERM）视觉研究所的发育神经科学家AlainChédotal表示：“我们认为基于溶剂的方法在可重复性和成本方面是最为可靠的。”

　　通常情况下，基于溶剂的方法通常最适合使用荧光标记的抗体作为报告分子，因为天然表达的荧光蛋白倾向于产生较弱的信号或在处理后发生变性。但Ertürk团队对3DISCO进行了改良，进而克服了这个问题。

　　vDISCO使用染料标记的“纳米抗体”来增强溶剂清除后组织中荧光蛋白的信号——该团队就是用这种方法对小鼠的大脑进行了清理并完整成像（参见go.nature.com/2tk6hr3）。

　　另一种广泛使用的组织清除方法是CLARITY，它是2013年Gradinaru在斯坦福大学神经科学家Karl Deisseroth的实验室里帮助开发出来的。Deisseroth实验室在其神经科学研究中广泛使用荧光蛋白，并不断寻求更“自然的”清除方法，以最大限度地减少对目标生物分子的损害。

　　CLARITY使用清洁剂来消除脂质，同时通过多聚物形成水基水凝胶来强化组织框架。Gradinaru解释说：“所有这些单体都互相连接着，固定在蛋白质中。接着你就可以使用这种温和的清洁剂来清除脂质了。”

　　早期的CLARITY具有一定技术难度，需要利用电场主动清洗出洗涤剂包裹着的脂质。Gradinaru随后设计了一种更简单的替代方案，用清洁溶液灌注动物的脉管系统，达到同样的效果。

　　Ueda则开发了另一种CUBIC方法。CUBIC利用“亲水性”化学物质将水吸入固定的样品中，同时将溶解了的脂质推出。与CLARITY一样，该方法在澄清样品的同时保留了荧光蛋白的结构和功能。

　　不仅仅是大脑——组织清除技术的扩展应用

　　组织清除方法使研究人员得以探索以前无法研究的神经科学问题。例如，Chédotal正在使用3DISCO探索整个视觉系统的结构。 “从眼睛往深处去，神经节细胞输出的信号可能会映射到30个不同的大脑部位，”他说， “我们尚不了解这些轴突究竟是如何找到不同目标的。”

　　但组织清除方法并不仅仅适用于大脑。“令我们惊讶的是，大多数啮齿动物器官在几天内就变得透明，”当Gradinaru提到她开发的基于灌注的CLARITY方法时说道，“除了皮肤和骨头，动物整个身体都被清理了。”

　　Gradinaru表示，骨骼是组织清除中的一个特殊挑战，因为在常规清除后，骨骼中残留的钙仍会反射光线。不过，额外加以处理便可以解决这个问题。例如，Ueda的团队已经证明，实验室常用的化学品EDTA能有效地去除骨骼中的钙。Gradinaru的团队还开发了一种能够对骨组织进行清除的CLARITY方法。

　　这些方法使得对完整标本进行全身成像成为可能，研究人员已将其应用于追踪罕见的干细胞群或肿瘤转移灶，甚至是孕早期人类胚胎里正在发育中的脉管系统和周围神经系统。然而，随着标本变大，显微镜技术可能成为一个瓶颈。研究人员必须在研究目标和可操作性之间寻求平衡。

　　光片显微镜是一种广泛使用的应对策略。“你扫描的是正在通过组织的一个光平面而非一个光点，这极大地加快了成像速度。”Deisseroth说。此外某些组织清除方法自带物理收缩效应。在3DISCO方法中，脱水最高可以将样品缩小至50%。“这意味着我们一次性就能够拍摄整个人体胚胎。”Chédotal说。

　　但目前的方法也只能止步于此了。对整个人体大脑进行了组织清除之后，Chédotal能够成像的区域只有几个立方厘米，约占整个大脑的1%。 “我可以让一头奶牛变得透明，”他说， “但我无法对它成像，那有什么意义呢？”

　　图像放大——标本扩展技术

　　清除是组织成像极有价值的起点，但为了了解更精细的分子层面的内容，研究人员还需要有特别的“放大”手段。

　　传统的光学显微镜无法区分间隔小于光的“衍射极限”的分子，大约是200纳米——这一问题推动了技术复杂的超分辨率显微镜的发展。麻省理工学院的神经生物学家Ed Boyden最初提议“吹大”大脑的时候的确是在开玩笑，但很快他就看到了这个想法背后的真正潜力。“细胞中的所有蛋白质都挤在一起，如果我们将它们彼此分开，也许我们可以更好地看到它们。”他说。

　　Boyden的研究小组花费了数十年时间研究水凝胶特性，这些水凝胶在水合过程中会成比例膨胀。2015年，他们发表了第一代“扩增显微镜”方法，他们用特殊设计的荧光标记处理样品以识别目标靶分子，然后将其与能够形成水凝胶基质的聚合物溶液一起孵育。这些标签分子附着在基质上，将其相对位置锁定。

　　最后，通过化学或酶处理将周围组织打破，通过水合的方式使凝胶基质膨胀。膨胀之后标签分子的相对位置仍然固定，但其距离可能是原始距离的四倍。于是，之前靠得太近的分子现在可以使用标准荧光显微镜来辨别了。

　　对于许多生物学家来说，这种方法看起来好得令人难以置信。华盛顿大学的生物成像研究员Joshua Vaughan回忆说：“我的第一反应是：‘这太疯狂了，怎么可能实现？’”但Vaughan对此非常感兴趣，并进行了相关尝试——随后设计了一种替代方法，即使用传统的荧光蛋白或抗体，而不是专门设计的标记试剂。

　　后来的改良方法包括Boyden小组的迭代方法：通过两轮处理实现高达20倍的放大；以及由麻省理工学院生物医学工程师Kwanghun Chung开发的另一种方法：使生物分子变性而不是消化它们，这样可以更好地保护内源性蛋白质和组织结构的完整性。

　　“我们使用这种方法对神经连接进行描绘，因为这种情况下我们需要保留神经纤维：一旦切断它们，就会丢失信息。”Chung说。最重要的是，这些不同的方法还可以诱导组织清除，使研究人员可以深入观察超大尺寸样本。

　　Vaughan的团队已将扩展显微镜用于多种标本的观察，比如果蝇幼虫、人类肾脏等，而其他研究人员正将其应用于临床场景（参见“透明的肿瘤”）。

　　但是，标本在扩展前需要“嫩化”，这种适宜的“嫩化”需要反复试验。“人的肾脏里有一些坚韧的结缔组织，”Vaughan说，“因此我们不得不持续尝试用酶来处理它。”扩张中保持“各向同性”或者说在所有方向都具有相同性也是至关重要的。

　　但是通过谨慎操作和反复试验，均匀扩展是可以实现的。“我们的结果表明，失真小于5%，这与安置样品时的失真率相近，甚至更低。”Chung说。

　　透明的肿瘤

　　随着免疫学和遗传学认识的不断更新，癌症医学正在快速发展。然而，癌症病理学依然和过去一样，依赖于对单个肿瘤组织切片进行染色和显微镜观察。日本大阪RIKEN生物系统动力学研究中心的系统生物学家上田泰己说：“这种方法非常老旧，年轻的临床科学家对此感到有些沮丧。”

　　组织清除则提供了另一种选择。例如在2017年，上田泰己及其同事表明，组织清除技术CUBIC比传统的制备方法具有更高的灵敏度，使临床医生可以观察更大的组织片段，从而发现那些原本可能被忽略的特征。“有时早期癌症会被误诊。”上田泰己说，“但如果你观察的是三维的且经过组织清除处理，那么就会很少漏诊。”

　　组织清除方法还能用于肿瘤生物学研究。斯坦福大学的神经生物学家Karl Deisseroth和瑞典卡罗琳斯卡医学院的PerUhlén利用一种改良的3DISCO方法对肿瘤异质性有了前所未有的了解——肿瘤异质性会深刻影响治疗反应。麻省理工学院的神经生物学家Ed Boyden及其团队已经证明，组织清除技术和高分辨率扩增显微镜有助于更准确地发现早期乳腺癌病变。

　　Boyden和Deisseroth都创立了公司以促进其技术的临床开发。一些组织清除的实践者已经预见到传统方法即将终结。“我们的技术让年轻的病理学家感到非常兴奋，”上田泰己说，“这似乎是他们的未来。”

　　未来前景

　　对于资金短缺的生物学家来说，扩展显微镜就是福音，它既能够实现超高分辨率成像，又无需昂贵的硬件设备。“基本上任何人都可以操作它，”柏林自由大学的细胞生物学家Helge Ewers说，“任何普通的显微镜都可以成为超高分辨率显微镜。”最重要的是，所需的试剂不必特殊设计，只不过需要反复尝试才能找到正确的配比。

　　Chédotal指出，对整只小鼠进行组织清理大约只需花费1美元。设备要求也不高，“你只需将器官放入化学物质中，需要的设备只有孵育箱和摇床——大多数实验室都有。”上田泰己说。

　　从技术角度说，标本扩展比纯粹的组织清除要求更高，但Boyden和其他人已经发表了“最佳操作”指南，减少了研究人员使用扩增显微镜时不必要的摸索。“这还不完全是一本‘操作步骤书’，但我们正在努力接近。”Boyden说。

　　研究人员已经开始探索如何有效利用这些方法。多个大脑图谱项目正在进行中，其目标不仅仅是单个细胞，还有细胞之间的连接。其他科研人员正在尝试对DNA和RNA进行清除和扩展，以深入研究基因表达和蛋白质。

　　哈佛大学的生物物理学家庄小威设计了一种基于扩展显微镜方法，能够对单个细胞RNA水平上100多个基因的表达进行量化。与此同时，Deisseroth及其同事开发了一种名为STARmap的技术，可以在经过组织清除后的大脑中对1，020个不同的基因进行直接测序。

　　这些方法得到的数据可以用于识别单个细胞。但也可以与回路图、活体动物实验相结合，揭示大脑内部结构和功能的相互关系以及那些从前未被发现的连接。

　　“因为保留了组织中细胞的三维位置，我们应该能够记录细胞层面的转录组学数据、连接组学数据以及实时收集的活体动物细胞层面的活动模式。”Deisseroth说， “组织清除能够让人将这些完全不同的数据综合起来。”